Mastroeni w roli defensywnego pomocnika rozegrał szesnaście sezonów na poziomie Major League Soccer, co oznacza łącznie 334 mecze od debiutu w 1998 roku.
Ostatnio zawodnik Los Angeles Galaxy urodził się w Argentynie, jednak od 1980 roku mieszkał w Stanach Zjednoczonych, do których przenieśli się wówczas jego rodzice. Karierę rozpoczynał w barwach uniwersyteckiego North Carolina State Wolfpack oraz Tucson Amigos. W wieku 22 lat trafił do MLS do niesitniejącego już Miami Fusion. Tam rozegrał 100 spotkań, aby w 2002 roku przeprowadzić się do Colorado Rapids, w którym spędził ponad dekadę.
Mastroeni, znany przede wszystkim ze znakomitego przygotowania fizycznego, był 65-krotnym reprezentantem USA. Pojechał z amerykańską kadrą m.in. na Mistrzostwa Świata w 2002 i 2006 roku. Tylko raz w karierze zdobył mistrzostwo MLS - w 2010 roku w barwach Rapids.